L'enzymologie industrielle Travaux pratiques

L'enzymologie industrielle
Travaux pratiques d'enzymologie consistant à tester l'activité enzymatique du phosphatase alcaline en fonction de différentes concentrations en substrats.
№ 13637 | 1,980 mots | 0 sources | 2010
Publié le févr. 15, 2010 in Biologie , Physique
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Résumé:

La phosphatase alcaline est une enzyme qui hydrolyse des esters de phosphate. Elle est retrouvée dans le génome des êtres vivants supérieurs. Le dosage de cette enzyme a un grand intérêt dans les diagnostics, comme pour les maladies du foie. Celle ci est dosée dans le sang, car lorsque les cellules sont détruites par la maladie (lyse), l'enzyme est libérée dans le sang. Le substrat utilisé est le para-nitrophénylphosphate (PNPP). Il sera hydrolysé en paranitrophénol (PNP) en milieu alcalin, ce produit formé donne une couleur jaune au milieu. Le PNP obtenu étant jaune, l'absorbance sera lue à 405 nm. Le pH optimal de l'enzyme est compris entre 9 et 10,5. Un tampon est donc utilisé, c'est le DEA (diéthanolamine).

Extrait du document:

On cherche maintenant à calculer l'activité de l'enzyme. On prépare 5 ml d'une solution de PNPP à 25 mM, pour cela, on pèse 46,4 mg de PNPP (MM=371,15g/mole). Puis une solution d'enzyme : 10g de sulfate d'ammonium, 20mg d'Albumine de serum bovin pour empêcher la fixation de l'enzyme sur les parois, le tout dans 200ml d'eau. On prépare ensuite 2,5ml d'une solution d'enzyme stock à 2mg/L que l'on dilue 150 fois dans du Tampon DEA . On remplit 4 puits avec 140µL de tampon DEA, 40µL de solution de Substrat et 20µL d'enzyme diluée ; 1 puits avec 160µL de tampon DEA et 40µL de solution de substrat ; 1 puits avec 140µL de tampon DEA, 40µL de solution de substrat, et 20µL de solution pour enzyme. On mesure ensuite la variation de l'absorbance de ces 6 échantillons avec 7 mesures en une minute.

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